共聚焦顯微鏡是一種利用??激光點(diǎn)光源與空間針孔濾波技術(shù)??，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品??光學(xué)“斷層掃描”成像??的高分辨率顯微儀器。它通過(guò)物理手段排除離焦雜散光，顯著提升圖像對(duì)比度和分辨率，尤其適用于厚樣品的三維重構(gòu)與活體動(dòng)態(tài)觀測(cè)。
??一、核心原理??
??1點(diǎn)照明 & 點(diǎn)探測(cè)??
激光束聚焦為??微小光點(diǎn)??(衍射極限級(jí))照射樣品。
發(fā)射光(熒光/反射光)通過(guò)??針孔，僅允許??焦平面信號(hào)??通過(guò)探測(cè)器，阻擋離焦背景光。
??2光學(xué)切片??
通過(guò)逐點(diǎn)掃描樣品平面，并逐層移動(dòng)聚焦位置，獲得??系列二維薄層圖像??。
疊加所有切片可重建??三維立體結(jié)構(gòu)??。?
二、 共聚焦顯微鏡核心優(yōu)勢(shì)
1.出色的光學(xué)切片能力與三維重建：
消除非焦面模糊，獲得樣品內(nèi)部特定深度的清晰圖像。
通過(guò)Z軸步進(jìn)掃描，獲取一系列二維“光學(xué)切片”，經(jīng)計(jì)算機(jī)處理可精確重建樣品的三維結(jié)構(gòu)。這是研究細(xì)胞器空間分布、組織形態(tài)、材料表面/內(nèi)部結(jié)構(gòu)的基石。
2.高分辨率與高對(duì)比度：
X-Y分辨率接近光學(xué)衍射極限(~200 nm)，Z軸分辨率(~500 nm)顯著優(yōu)于寬場(chǎng)顯微鏡(~1000-2000 nm)。
“針孔效應(yīng)”極大抑制背景噪聲，提升圖像信噪比(SNR)和對(duì)比度，尤其對(duì)厚樣本或弱熒光信號(hào)至關(guān)重要。
3.強(qiáng)大的多色熒光成像能力：
利用多種不同激發(fā)波長(zhǎng)的激光器和精密的熒光分光探測(cè)系統(tǒng)(如聲光可調(diào)濾光器AOBS， 二向色鏡， 光譜探測(cè)器)，可同時(shí)對(duì)同一樣品中的多個(gè)不同標(biāo)記物進(jìn)行成像。
高級(jí)光譜拆分技術(shù)(線(xiàn)性拆分)可有效分離發(fā)射光譜高度重疊的熒光染料，實(shí)現(xiàn)更精確的多色分析。
4.活細(xì)胞成像工具：
點(diǎn)掃描(尤其共振掃描)和轉(zhuǎn)盤(pán)共聚焦為觀察活細(xì)胞內(nèi)快速、動(dòng)態(tài)的生理過(guò)程提供了可能。
結(jié)合環(huán)境控制系統(tǒng)(溫控、CO?、濕度)，可在接近生理?xiàng)l件下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間(數(shù)小時(shí)甚至數(shù)天)觀察，研究細(xì)胞遷移、分裂、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、藥物反應(yīng)等。
5.定量分析平臺(tái)：
熒光強(qiáng)度定量分析(如蛋白表達(dá)量、離子濃度變化)。
共定位分析(研究分子間的空間關(guān)系)。
熒光漂白后恢復(fù)(FRAP)及其變種：研究分子流動(dòng)性、相互作用、細(xì)胞器連通性。
熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)：檢測(cè)分子間相互作用距離(<10 nm)。
熒光壽命成像(FLIM)：提供分子微環(huán)境信息(如pH、離子濃度、分子結(jié)合狀態(tài))，是定量FRET的重要手段。
熒光相關(guān)光譜(FCS)/熒光互相關(guān)光譜(FCCS)：在極微小體積內(nèi)分析分子擴(kuò)散系數(shù)、濃度、相互作用。
三、核心組件與技術(shù)
1.激光光源：
多譜線(xiàn)激光器： 提供多個(gè)固定波長(zhǎng)的激發(fā)光(如405nm, 488nm, 561nm, 640nm)。
白光激光器(WLL)： 提供連續(xù)可調(diào)的激發(fā)波長(zhǎng)，極大提升實(shí)驗(yàn)靈活性。
飛秒/皮秒激光器： 用于多光子激發(fā)。
2.掃描系統(tǒng)：
振鏡掃描器： 核心組件，控制激光束在X-Y方向精確掃描。
共振掃描器： 用于高速掃描。
轉(zhuǎn)盤(pán)掃描器： 用于轉(zhuǎn)盤(pán)共聚焦。
3.探測(cè)系統(tǒng)：
光電倍增管(PMT)： 傳統(tǒng)探測(cè)器，靈敏度高。
混合探測(cè)器(HyD)： 結(jié)合PMT高增益和雪崩二極管(APD)高量子效率、低噪聲。
雪崩光電二極管(APD)： 速度快，用于FLIM/FCS等。
科學(xué)級(jí)sCMOS相機(jī)： 用于轉(zhuǎn)盤(pán)共聚焦、光片、寬場(chǎng)超分辨。
4.分光系統(tǒng)：
聲光可調(diào)濾光器(AOTF)： 快速、精確調(diào)節(jié)激光強(qiáng)度和波長(zhǎng)。
聲光分束器(AOBS)： 利用聲光效應(yīng)進(jìn)行高效、快速、無(wú)串?dāng)_的分光(替代二向色鏡，徠卡TCS核心)。
二向色鏡/濾光片輪： 傳統(tǒng)分光元件。
光譜探測(cè)器： 收集發(fā)射光的光譜信息，用于光譜拆分。
5.精密物鏡：
高數(shù)值孔徑(NA)油鏡、水鏡、甘油鏡、硅油鏡、空氣鏡。
復(fù)消色差(APO)物鏡。
長(zhǎng)工作距離(WD)物鏡。
專(zhuān)用物鏡(如活細(xì)胞專(zhuān)用、多光子專(zhuān)用、TIRF專(zhuān)用)。
6.軟件平臺(tái)：
核心控制： 硬件控制(激光、掃描、探測(cè)、載物臺(tái)、Z軸)、圖像采集。
圖像處理與分析： 去噪、反卷積、3D/4D可視化、定量分析(強(qiáng)度、共定位、形態(tài)、FRAP、FRET、FLIM、FCS等)。
實(shí)驗(yàn)管理： 多維實(shí)驗(yàn)、宏編程、自動(dòng)化。
代表軟件： 尼康NIS-Elements， 徠卡LAS X， 蔡司ZEN， 奧林巴斯cellSens。
四、 共聚焦顯微鏡應(yīng)用領(lǐng)域
1.生命科學(xué)研究：
細(xì)胞生物學(xué)： 細(xì)胞器結(jié)構(gòu)與動(dòng)態(tài)(線(xiàn)粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體、細(xì)胞骨架)、細(xì)胞分裂、細(xì)胞遷移、囊泡運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞間通訊。
神經(jīng)科學(xué)： 神經(jīng)元形態(tài)(樹(shù)突棘、軸突)、突觸結(jié)構(gòu)與功能、神經(jīng)回路、鈣成像、神經(jīng)遞質(zhì)釋放。
發(fā)育生物學(xué)： 胚胎發(fā)育、組織形成、器官發(fā)生(活體成像)。
免疫學(xué)： 免疫細(xì)胞遷移、免疫突觸形成、病原體-宿主細(xì)胞相互作用。
微生物學(xué)： 細(xì)菌/真菌形態(tài)、生物膜結(jié)構(gòu)、病原體侵染過(guò)程。
藥理學(xué)與藥物開(kāi)發(fā)： 藥物靶點(diǎn)定位、藥物細(xì)胞內(nèi)分布、藥效評(píng)估(如細(xì)胞凋亡、增殖)、高通量篩選(轉(zhuǎn)盤(pán)共聚焦)。
2.臨床醫(yī)學(xué)：
病理學(xué)： 組織切片的高分辨率、高對(duì)比度成像(尤其熒光標(biāo)記的特定蛋白或核酸)，輔助診斷。
眼科： 角膜、視網(wǎng)膜成像。
輔助生殖： 胚胎質(zhì)量評(píng)估(非侵入性)。
3.材料科學(xué)：
表面形貌與粗糙度分析： 高精度三維表面成像。
薄膜與涂層分析： 厚度測(cè)量、均勻性、缺陷檢測(cè)。
聚合物科學(xué)： 相分離結(jié)構(gòu)、結(jié)晶形態(tài)、添加劑分布。
半導(dǎo)體與微電子： 器件結(jié)構(gòu)、線(xiàn)路檢查、缺陷定位。
地質(zhì)與礦物學(xué)： 礦物成分分布、孔隙結(jié)構(gòu)分析。
法醫(yī)學(xué)： 微量物證(纖維、油漆、粉塵)的精細(xì)結(jié)構(gòu)觀察和成分分析。
